Medição do comprimento dos telômeros com flow-FISH para exame rápido de um grande número de células

O comprimento dos telômeros depende da idade da célula e do número de vezes que a célula se dividiu, sendo considerado um marcador da história replicativa celular e da capacidade de replicação restante. Portanto, a avaliação do comprimento dos telômeros é de grande importância como ferramenta de pesquisa em estudos de câncer, telomeropatias e outros distúrbios da biologia dos telômeros.

A relevância dos telômeros e da telomerase 

Os telômeros em todos os vertebrados são compostos por uma sequência em tandem de seis nucleotídeos (TTAGGG) repetida várias milhares de vezes. O comprimento dos telômeros e a atividade da telomerase são fatores importantes na patobiologia de várias doenças humanas, pois, durante o processo de síntese de DNA e divisão celular, os telômeros encurtam como resultado da replicação incompleta dos cromossomos lineares. Esse encurtamento progressivo dos telômeros é um dos mecanismos moleculares subjacentes ao envelhecimento e perda de viabilidade celular. 

A telomerase é uma enzima ribonucleoproteica que funciona como uma transcriptase reversa, regulando positivamente o comprimento dos telômeros, alongando as extremidades. Está provado que a ativação da telomerase é necessária para prolongar o tempo de vida das células humanas, evitando o encurtamento dos telômeros (1). Nas células somáticas, a atividade da telomerase geralmente diminui após o nascimento, de modo que o comprimento dos telômeros é gradualmente encurtado com as divisões celulares desencadeando a senescência celular. Nas células-tronco embrionárias, a telomerase é ativada e mantém o comprimento dos telômeros e a imortalidade celular. No entanto, o nível de atividade da telomerase é baixo ou ausente na maioria das células-tronco, independentemente de sua capacidade proliferativa. Quase 90% dos tumores primários humanos expressam telomerase, enquanto as células da maioria dos tecidos normais carecem dessa atividade enzimática. Portanto, a atividade da telomerase e a preservação do comprimento dos telômeros são fatores importantes no estudo dos processos cancerígenos.

Figura A. Gráfico de pontos da altura de FL1 versus altura de FL3 de células hibridizadas com solução de hibridização do kit Telomere PNA/FITC sem a sonda de PNA telomere. Os gates são colocados em torno das células na fase G0/1 para ambas as células de amostra (células mononucleares humanas isoladas do sangue) e células de controle (linha celular 1301).

Figura B. Gráfico de pontos da altura de FL1 versus altura de FL3 de células hibridizadas com a sonda telomere PNA/FITC na solução de hibridização do Telomere PNA Kit/FITC. Os gates são colocados em torno das células na fase G0/1 para ambas as células de amostra (células mononucleares humanas isoladas do sangue) e células de controle (linha celular 1301).

Medindo o comprimento dos telômeros utilizando a tecnologia flow-FISH

Flow-FISH é um método que combina hibridização in situ fluorescente (FISH) com citometria de fluxo, utilizando sondas de ácidos nucleicos de peptídeos marcados (PNA) que hibridam com repetições de telômeros em células em suspensão. A tecnologia Flow-FISH aplicada para medir o comprimento dos telômeros permite o exame rápido de um grande número de células com a possibilidade de usar a estratégia de gating que exclui células danificadas. A tecnologia flow-FISH também serve como uma ferramenta poderosa para examinar o comprimento dos telômeros em diferentes tipos de células e tecidos, além de poder ser modificada para avaliar e detectar simultaneamente fenótipos celulares e citocinas intracelulares com a avaliação do comprimento dos telômeros. 

As vantagens da tecnologia flow-FISH permitem a triagem em larga escala de amostras para alterações no comprimento dos telômeros em vários laboratórios de pesquisa com resultados reprodutíveis e confiáveis.

Um estudo (2) foi realizado para comparar métodos de medição de telômeros. No estudo, o padrão-ouro da análise do fragmento de restrição terminal (TRF) por Southern blot foi comparado ao flow-FISH e qPCR para medir o comprimento dos telômeros de leucócitos do sangue periférico humano. Parâmetros como variabilidade intra e interensaio, sensibilidade e especificidade do flow-FISH e qPCR foram avaliados. O estudo demonstrou que o flow-FISH apresentou uma melhor correlação com a análise padrão-ouro TRF por Southern blot em comparação com qPCR (Tabela 1). Além de ser mais exato, preciso e reprodutível, o flow-FISH também apresentou melhor sensibilidade e especificidade, especialmente em pacientes com telômeros mais curtos.

Kit Telomere PNA/FITC da Agilent para citometria de fluxo

O Telomere PNA Kit/FITC para Citometria de Fluxo é baseado no princípio FISH de fluxo e destina-se à detecção de telômeros em células hematopoiéticas nucleadas utilizando uma sonda de ácido nucleico de peptídeo conjugado com fluoresceína (PNA). O conjunto pode ser utilizado para a detecção de telômeros de todos os vertebrados hematopoiéticos nucleados células. Os resultados são avaliados por citometria de fluxo através de uma fonte de luz com excitação a 488 nm. A sonda não reconhece sequências subteloméricas, e em contraste com as medições tradicionais do fragmento de restrição do telômero (TRF), o kit, portanto, permite uma estimativa do comprimento dos telômeros sem inclusão de subtelômeros.

O kit foi projetado para que os tratamentos pós-hibridização sejam mantidos em um nível de lavagens mínimas e com formamida são evitadas. O kit utiliza sondas PNA, que são superiores às sondas de DNA em termos de sensibilidade e especificidade (3). O método é ideal para estimar o comprimento dos telômeros, pois a intensidade de fluorescência do células está diretamente correlacionada com o comprimento do telômero (4, 5).

Vantagens do kit Telomere PNA/FITC da Agilent para citometria de fluxo

• Permite uma estimativa do comprimento dos telômeros sem inclusão de subtelômeros, em contraste com as medições tradicionais de fragmentos de restrição de telômeros (TRF);
• Foi otimizado, de modo que os tratamentos pós-hibridização são reduzidos ao mínimo e as lavagens de formamida são reduzidas;
• Utiliza uma sonda de PNA, superior às sondas de DNA em termos de sensibilidade e especificidade;
• É adequado para triagem em larga escala de amostras em vários laboratórios com resultados reprodutíveis e confiáveis;
• Fornece uma técnica mais exata, precisa e reprodutível quando comparada com TRF e qPCR para medir o comprimento dos telômeros.